Het is Peter Parker (Tobey Maguire) eindelijk gelukt een evenwicht te vinden tussen zijn liefde voor M.J. (Kirsten Dunst) en zijn plichten als superheld. Maar er ligt onheil op de loer als de donkere kant van Spider-Man naar boven komt en hij die niet onder controle weet te houden. Peter wordt overmoedig, hij gaat in op de avances van Gwen Stacy en negeert de mensen die het meest om hem geven. Hij wordt gedwongen te kiezen tussen de verleidelijke kracht van zijn nieuwe donkere outfit en de meelevende held die hij eerst was. Ondertussen blijken de nieuwe slechterikken, Sandman en Venom, te beschikken over ongeëvenaarde krachten die een overmoedige Spider-Man niet zal kunnen tegenhouden...